近年来，工业废水，特别是印染行业废水，其核心治理难点在于溶解态顽固有机氮化合物（如N-杂环、芳香胺类）与颗粒态PET微塑料的复合污染。这两类污染物化学性质迥异、结构稳定，传统工艺各自为政——生物硝化针对无机氮、高级氧化针对溶解物、膜过滤针对颗粒物，难以同步应对；而天然藻菌共生体虽被视为可持续平台，却受限于微藻对高浓度染料的敏感性和现有工程细菌对PET降解效率的低下，始终停留于概念验证阶段。

  近日，由中国科学院深圳先进技术研究院定量合成生物学全国重点实验室/合成生物学研究所Howard H. Chou正高级工程师领衔的研究团队在环境工程领域国际权威期刊Bioresource Technology发表重要研究成果"Synthetic microalgal–bacterial symbiotic system integrating oxidase-protease fusion enzyme for simultaneous removal of recalcitrant nitrogen-containing organic compounds and PET microplastics"。

  本研究打破“单一物种”思维定式，通过合成生物学手段构建人工菌藻分工协作体系：将顽固有机氮降解功能赋予工程化小球藻，将PET微塑料降解功能交由改造的恶臭假单胞菌执行，并利用碳-信号交换回路（胞外多糖与吲哚-3-乙酸互惠）将两者紧密耦合，旨在为复合污染物的协同治理提供全新设计路径。

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原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852426017670

  研究团队在分子层面取得关键突破，在微藻中发现了一种此前未知的氧化酶-蛋白酶融合酶（A20674）——其氧化酶结构域广谱去除N-杂环与芳香族化合物，蛋白酶结构域负责有机氮矿化，为微藻去除顽固含氮污染物奠定了首个酶学基础。基于此，团队理性组合工程化小球藻与恶臭假单胞菌，形成互惠增强的正反馈循环：小球藻分泌胞外多糖为细菌供碳，细菌回馈IAA促藻生长并同步降解含有有机污染物和PET微塑料。该优化菌群将有机氮浓度降低16倍（达≤5 mg/L的国家排放标准），顽固有机氮去除提升5倍，PET微塑料去除提升9倍——实现了溶解态含氮物与颗粒态塑料的集成去除，这是单一生物或传统工艺无法达成的组合。该成果不仅揭示了一种双功能酶架构用于降解结构多样的工业污染物，也为后续藻类污水处理技术的智能化、模块化设计提供了可拓展的合成生态学框架。

  废水驯化揭示关键氧化酶

  研究团队首先将小球藻在印染废水中驯化三个月。结果显示，延长光照时间可大幅提升生物量积累和营养物去除，但有机氮去除呈现独特的阈值响应——光照超过18小时后去除率方才显著提升，连续光照下达最大水平。即便如此，残余有机氮浓度仍高于中国印染废水排放标准（GB 4287-2012）及欧盟相关指令要求。

  转录组分析发现多种种氧化酶相关基因在废水条件下被强烈诱导。其中仅A23292与A20674两个异类污染物降解相关基因能使未驯化细胞直接在印染废水中生长。在不同类型废水（市政、酿造、畜牧、印染废水）中的评估显示，质粒过表达这两个酶可使COD去除提升4-6倍，氨氮去除提升3-7倍，有机氮去除提升2-55倍。

  在底物特异性层面，研究团队针对六大类代表性含氮污染物进行了系统测试：芳香族染料（吲哚、四氢喹啉、偶氮苯）、除草剂（敌草快）及兽用抗生素（林可霉素、恩诺沙星）。结果显示，氧化酶过表达使吲哚、四氢喹啉和偶氮苯的去除率提升4-6倍，并首次实现了对敌草快、林可霉素和恩诺沙星的降解（图1）。

  图1. 过表达氧化酶的小球藻对工业废水的处理效果。比较质粒过表达与染色体整合过表达两种方式下，(a)化学需氧量（COD）的去除率；(b)氨氮的去除率；(c)有机氮的去除率；(d)总磷的去除率；(e)含氮有机化合物的去除率；(f)在含氮有机化合物存在条件下，过表达氧化酶后微藻生长量的变化。EV：空载体对照；P&D：印染废水，Muni.：市政废水；Brew.：酿造废水；PD：养猪场废水；DFD：养鸭场废水。

  双功能融合酶的结构解析与功能分区

  A20674表现尤为突出——它在市政、酿造和畜牧废水中的有机氮去除效果甚至超越了经典P450酶A23292。AlphaFold建模揭示其独特结构：N端为氧化酶样区域，C端为蛋白酶样结构域。数据库检索发现单个结构域在微藻中存在同源物，但此前从未报道过同时包含这两种结构域的单条多肽蛋白。

  更有趣的是，将此蛋白的两个结构域分别独立表达后，测试结果呈现出明确的功能分工：蛋白酶样结构域单独即可再现全酶绝大部分的有机氮去除能力，在三种废水中稳定超越氧化酶结构域3-4倍；而氧化酶结构域则主要负责六种顽固含氮化合物的去除。这意味着A20674在单条蛋白中整合了两种功能。

  图2. 氧化酶-蛋白酶融合蛋白A20674的结构分析。(a)A20674的BLASTP比对分析结果。(b)AlphaFold3预测的A20674（左）与P450-细胞色素P450还原酶（CPR）融合蛋白CYP102A1（右）的三维结构。(c)A20674（左）与CYP102A1（PDB编号：1JPZ，右）活性位点比较。

  藻菌互惠机制的揭示与工程放大

  尽管工程化小球藻能有效去除溶解态污染物，微塑料去除仍因蛋白表达量低而受限。研究团队转而构建人工微藻-细菌共生体系：将恶臭假单胞菌（P. putida PP1a）引入体系，发现该菌株单独无法在印染废水中增殖，但与小球藻共培养后生长恢复—关键证据在于微藻分泌的胞外多糖（EPS）在共培养中被消耗高达41%，证实细菌以微藻释放的碳源为生。

  更重要的是，这种关系是双向互惠的：共培养同时提升了微藻的生长和营养物去除效率。机理上，恶臭假单胞菌分泌的IAA促进了微藻生物量及EPS产量提升，而EPS反过来又保护微藻细胞免受废水中有毒化合物的侵害，为氧化酶解毒争取了关键时间窗口。

  为了进一步增强互惠循环，团队进行了双向工程改造：在小球藻中过表达EPS合成相关基因（A16215或A19684），在恶臭假单胞菌中增强EPS分解代谢能力。同时，经过定向进化进化和分子改造相结合，获得了一株PET降解菌株B84，其不仅PET去除能力提升4倍，IAA产量也意外提高了3倍，完美契合了共生体系的需求（图3）。

  图3. 人工合成微藻-细菌共生体系的工程化构建。(a)刚果红染色显示胞外聚合物（EPS）的分布情况；(b)在印染废水中，小球藻单独培养（Cv）或与恶臭假单胞菌PP1a共培养（Cv + PP1a）72小时后，EPS中单糖组成及含量分析。(c)比较小球藻与PP1a共培养体系中，过表达IAA合成通路（+IAA）与未过表达（−IAA）条件下，相对于小球藻单独培养对照组的营养物去除效率变化。(d)过表达EPS生物合成相关基因后，EPS总含量及藻细胞密度的变化。

  工程化菌藻共生系统实现顽固有机氮与PET微塑料同步去除

  集成所有工程化模块后，最优体系（含PET酶/EPS降解增强型恶臭假单胞菌，以及过表达A23292/A20674和EPS增产基因的小球藻）展现出惊人性能：

  PET微塑料去除提升9倍，塑料碎片去除提升5倍，相较于仅过表达PETase/MHETase的小球藻对照组；有机氮浓度降至5 mg/L以下，满足中国及欧盟排放标准；在含偶氮苯或活性黑5的限定成分印染废水中，染料去除提升5倍，PET微塑料去除提升4倍。除此之外该共生体系在厨余废水和含恩诺沙星、敌草快、偶氮苯的培养基中也得到了验证，结果与印染工业废水一致：B84与氧化酶过表达小球藻联用使有机氮去除提升6倍，EPS增产再额外提升3倍；对三种顽固化合物的去除提升21–45%。

  图4. 微藻-细菌共生系统对PET塑料及有机氮的去除效果。(a)印染废水中PET微塑料粉末经5天处理后的去除情况。(b)在基础培养基中，一次性塑料餐盘经60天处理后的降解去除情况。(c)由工程化PP1a（过表达PETase/MHETase及PP1228）与过表达氧化酶及EPS合成基因（A16215或A19684）的小球藻所组成的共生体系，在印染废水中对PET微塑料粉末的去除效果。(d)在上述过表达PETase/MHETase及PP1228的共生体系条件下，有机氮（Org.N）的去除效果。

  本研究提供了三项核心贡献：第一，首次鉴定并功能表征了微藻中的氧化酶-蛋白酶融合酶A20674——其氧化酶结构域负责广谱去除N-杂环与芳香族化合物，蛋白酶样结构域负责有机氮去除，为微藻去除顽固有机污染物建立了首个分子机制基础；第二，解析了小球藻与恶臭假单胞菌的互惠关系——EPS供碳与IAA促生构成的代谢交换回路，并通过工程手段放大该互惠效应；第三，将氧化酶、EPS过表达微藻与PET酶工程菌整合于单一人工合成菌藻共生体系中，首次实现了溶解态顽固含氮有机物与颗粒态微塑料的同步去除，有机氮达标排放的同时PET微塑料去除较纯培养提升9倍。

  该研究不仅揭示了一种双功能酶架构用于降解结构多样的工业污染物，更建立了一个合成生态学框架——将代谢功能分配于经理性设计的微生物伙伴之间，通过分子交换互联——为应对工业废水中多污染物共存的现实挑战提供了机理与工程基础，这是任何单一生物或传统处理工艺都无法企及的。

  中国科学院深圳先进技术研究院定量合成生物学全国重点实验室/合成生物学研究所Howard H. Chou正高级工程师为本文的通讯作者，课题组助理研究员肖睿为本文的第一作者，中国科学院深圳先进技术研究院为本文第一完成单位。本研究得到了国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金的资助以及深圳合成生物学创新研究院等项目的支持。