巨噬细胞是免疫系统中不可或缺的组成部分，广泛分布在不同组织中，并在发育、器官形成、稳态维持和疾病发生发展中发挥关键作用[1]。巨噬细胞异质性显著，主要表现在形态、定位、基因表达谱及功能等方面，这些表型由巨噬细胞的发育起源和驻留的微环境所决定[2]。具有组织特异性特征的巨噬细胞包括中枢神经系统的小胶质细胞（Microglia）、肝脏的枯否细胞（Kupffer cells）和表皮的朗格汉斯细胞（Langerhans cells）等。还有一些分布于多个器官的巨噬细胞，如血管周围巨噬细胞（Perivascular macrophages）。基于啮齿类动物的研究结果，学术界对巨噬细胞亚型的多样性、发育起源以及组织特异性的形成有了一定的认识[3]。然而，这些发现是否适用于人类仍是未知数，特别是人类胚胎发育过程中巨噬细胞的多样性、发育起源、功能及成熟的动态过程等问题还缺乏深入而全面的研究。
2023年9月12日，中国科学院深圳先进技术研究院李汉杰课题组联合深圳市宝安区妇幼保健院、深圳大学、上海交通大学和复旦大学等单位在Cell期刊上在线发表了题为“An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development”的文章。研究团队结合单细胞转录组测序、先进的生物信息学手段、多重免疫荧光染色、体外功能实验等技术构建了横跨18个发育阶段、19种组织的人类胚胎免疫系统发育高分辨率图谱。研究团队重点关注了最具组织特异性的巨噬细胞，鉴定了15种巨噬细胞亚型，其中包括两种新的巨噬细胞亚型，即存在于表皮、睾丸、心脏等外周组织的类小胶质细胞（Microglia-like cells）和具有血管生成促进功能并广泛分布于多个组织中的促血管生成巨噬细胞（Proangiogenic macrophages, PraM）。该研究通过构建人类产前免疫细胞发育的时空动态图谱，揭示了多种巨噬细胞亚型在发育过程中的分化起源、空间定位、功能特征及转录调控机制。
文章截图
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.08.019
人类免疫系统发育的单细胞时空图谱
研究团队对来自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19种人类胚胎组织样本的免疫细胞进行了单细胞转录组测序，获得了近30万个高质量的免疫细胞(图1)，并鉴定了11种主要的免疫细胞类型，包括：巨噬细胞（Macrophages）、祖细胞（Progenitor cells）、B 淋巴细胞、T 淋巴细胞、先天淋巴细胞（Innate-like lymphocytes）、自然杀伤细胞（Natural killer cells）、树突状细胞（Dendritic cells）、单核细胞（Monocytes）、巨核细胞（Megakaryocytes）、粒细胞（Granulocytes）和红细胞（Erythrocytes）。在此基础之上，研究团队对每一种主要的免疫细胞类型进行了更细致的分类，最终注释得到56种免疫细胞亚型。
研究人员重点对巨噬细胞进行了研究并将其进一步细分为了15个亚群。通过时空分析，他们发现在人类胚胎发育时期，巨噬细胞就已经具有了显著的组织特异性。在4 PCW左右（器官初形成阶段），巨噬细胞前体就已经出现在胚胎以及卵黄囊中并一直持续到大概8 PCW，直到被成熟的组织驻留巨噬细胞所替代。在这些巨噬细胞中，一部分亚型具有显著的组织特异性特征，如中枢神经系统中的小胶质细胞，肝脏中的枯否细胞、表皮中的朗格汉斯细胞等。而另外一部分亚型共享于多个组织中，如促血管生成巨噬细胞以及其前体细胞（pre-Proangiogenic macrophages, pre-PraM）。研究团队还发现肾上腺中有一群特有的组织驻留巨噬细胞（AXL+, FCGR3A+），睾丸中也存在一群特有的组织驻留巨噬细胞（MMP9+）和一群具有破骨细胞特征的巨噬细胞（ACP9+, SIGLEC15+, MMP9+）。
图1 构建人类免疫系统发育时空图谱
中枢神经系统之外的类小胶质细胞
|
|
在本研究中，研究人员首次在胚胎多个外周组织（皮肤、心脏及睾丸）中鉴定出一群和小胶质细胞有相似基因表达谱特征的巨噬细胞（图2）。这一发现打破小胶质细胞只存在于脑及脊髓中的传统认知。这群细胞高表达P2RY12, TMEM119, SALL1, C3等和小胶质细胞相同的特征基因，并且在无监督聚类分析中，这群细胞也和脑、脊髓中的小胶质细胞聚为一类。研究人员因此将这群新发现的分布在多个外周组织的细胞命名为类小胶质细胞（Microglia-like cells）。流式分析进一步验证了这群外周组织中的类小胶质细胞与中枢神经系统中的小胶质细胞一样，都呈现CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫荧光实验，发现类小胶质细胞在Carnegie Stages 12（CS12）时期就已经出现在表皮组织中。在14 PCW之前，类小胶质细胞一直是表皮中最主要的免疫细胞，此后细胞比例才开始逐渐减少，在20 PCW之后，基本被朗格汉斯细胞替代。在胚胎心脏中，类小胶质细胞最早出现在CS13的主动脉（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主动脉中最主要的免疫细胞。而成人主动脉组织中则检测不到这群类小胶质细胞。在胚胎睾丸中，类小胶质细胞最早能够在CS14的时候被检测到，主要存在于附睾（epididymis）中的输出小管（efferent duct）周围，而在睾丸实质（parenchyma）中比例则较低。
图2 外周器官中的类小胶质细胞与中枢神经中的小胶质细胞的表型一致
表皮和中枢神经系统均起源于外胚层，而主动脉和附睾则起源于主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros, AGM）区域。研究团队推测，小胶质细胞以及类小胶质细胞的前体从卵黄囊迁移到外胚层和 AGM 区域，随后在这两个区域独立分化为小胶质细胞或类小胶质细胞。
表皮驻留的类小胶质细胞呈极化分布，与神经嵴细胞互作并调控其分化
由于类小胶质细胞在表皮中最为丰富，研究团队进一步研究了它们在表皮组织中的功能。研究团队发现，与四肢和腹部皮肤相比，类小胶质细胞在背部和头部表皮中比例更高。在9 PCW时，背部表皮中几乎所有的免疫细胞都是类小胶质细胞，而四肢表皮中约60%的免疫细胞是类小胶质细胞。进一步定量分析表明，在胚胎发育不同阶段，背部表皮的类小胶质细胞都比四肢表皮更多，分布更密集（图3）。
类小胶质细胞在表皮中的极化分布模式与神经嵴细胞（neural crest cells， NCCs）的背外侧迁移路线（dorsolateral migration）有类似之处，因此研究人员猜测表皮的类小胶质细胞与NCCs之间可能存在某种互作。NCCs是外胚层衍生的多能干细胞，背外侧迁移时可分化为黑色素细胞（melanocytes）。通过多重免疫荧光实验，研究团队发现表皮中的类小胶质细胞和NCCs之间存在直接的相互作用。与之一致的是，研究团队观察到类小胶质细胞和黑色素母细胞（melanoblasts）的密度在不同发育阶段沿表皮的背-侧-腹轴（dorsal-lateral-ventral axis）逐渐降低（图3）。
|
|
为了评估类小胶质细胞对神经嵴细胞分化的影响，研究团队体外培养了来源于胚胎背部的新鲜皮肤组织块。在胚胎皮肤中清除类小胶质细胞显著减少了黑色素母细胞的数量，这提示了类小胶质细胞可能会调控神经嵴细胞向黑色素细胞的分化（图3）。
图3 表皮驻留的类小胶质细胞呈极化分布，与神经嵴细胞互作并调控其分化
广泛分布于多个脏器中的促血管生成巨噬细胞
研究团队在多个脏器中都鉴定到了一群高表达促血管生成基因（VEGFA, TNF, IL1B, CXCL8/IL8）的巨噬细胞，并且这群细胞在不同组织中都具有相似的基因表达谱。体外成管实验也证实了这群细胞促血管生成的功能。他们进一步分析发现，这群细胞在各个脏器中都富集在血管周围（图4）。
图4 促血管生成巨噬细胞富集在各个器官血管周围
研究团队又进一步分析了这群促血管生成巨噬细胞的发育起源。通过多种拟时序分析算法推断这群细胞是从卵黄囊起源的巨噬细胞前体分化而来，并且中间经历了一个相对不成熟的前体状态（pre-PraM）。拟时序分析推算出的分化轨迹与细胞的真实采样时间高度一致，并且其促血管生成信号也在随之增强。此外，研究团队用成管的内皮细胞上清液培养来源于卵黄囊的早期巨噬细胞前体，发现可以诱导出表达促血管生成基因的巨噬细胞。这些结果明确了这群促血管生成巨噬细胞的发育起源。
总而言之，该研究通过对人类产前阶段近30万个免疫细胞的单细胞转录组分析，着重描绘了15种巨噬细胞亚型的时空动态变化。突破性的发现了一群在转录组、特征蛋白表达、和形态上与中枢神经系统中的小胶质细胞类似且存在于皮肤、睾丸和心脏中的类小胶质细胞。它们是早期表皮中的主要免疫细胞群，沿背-侧-腹轴呈极化分布。这群类小胶质细胞可以与神经嵴细胞相互作用，并调节其向黑色素细胞的分化。通过功能、空间特征、分化轨迹的研究，研究团队还细致解析了一种尚未被充分了解的促血管生成巨噬细胞，它们驻留在多个器官的血管周围。这些促血管生成巨噬细胞与小胶质细胞均从起源于卵黄囊的巨噬细胞前体分化而来（图5）。该文章为研究人类巨噬细胞的异质性和发育提供了一个高分辨率的时空动态图谱，有助于理解其在发育过程中的不同作用。研究团队还开发了一个专门的可视化平台（http://119.8.233.169/），方便共享数据，促进研究成果的共同探索和领域发展。
图5 巨噬细胞前体分化为小胶质细胞/类小胶质细胞和促血管生成巨噬细胞；类小胶质细胞在表皮与神经嵴细胞互作，并调控其分化。
中国科学院深圳先进技术研究院李汉杰研究员、深圳市宝安区妇幼保健院朱元方教授、深圳大学总医院吴雪清教授、上海交通大学医学院Florent Ginhoux教授、复旦大学代谢与整合生物学研究院青年研究员王冠琳博士为本文共同通讯作者。中国科学院深圳先进技术研究院客座学生王泽帅（华中农业大学博士研究生）、吴志生（东南大学博士研究生）、研究助理冯若轻；深圳市宝安区妇幼保健院母胎医学研究所陈晓燕博士、王昊博士；复旦大学代谢与整合生物学研究院青年研究员王冠琳博士，厦门大学博士研究生李沐曦、以色列魏茨曼研究所王双寅博士为文章共同第一作者，深圳先进院为第一单位。本研究项目获得国家科技部重点研发计划、国家自然科学基金、深圳市科技计划、深圳市医学重点学科建设基金、复旦大学启动基金及深圳合成生物学创新研究院等项目的支持。
本文特别致谢深圳合成生物研究重大科技基础设施，在研究课题开展过程中，尤其是在单细胞转录组建库前的细胞分选及建库早期的关键步骤中需要使用大量384孔板，合成生物大设施的自动化、高通量平台发挥了不可替代的作用。在研究过程中，仅需要两到三名工作人员在一天内就能够制备上千块孔板，且每一块均能够按照实验要求添加细胞裂解液和引物，从而保证了实验的准确性和可重复性。合成生物大设施高效的工作方式使研究工作得到快速推进。研究团队期待未来能够继续与大设施合作，在合成生物学领域取得更多突破，为解决重大科学问题和应对国家发展需求提供助力。
实验室简介
李汉杰课题组采用“数据和假说双驱动”的研究范式，利用计算生物学，分子细胞生物学，临床样本和动物模型，深入探究人体免疫系统在发育，健康及疾病状态下的多样性、分化与功能。以第一或通讯作者（含共同）发表多篇高水平论文，包括Cell（2023，2019）、Cell Research（2020，2012）、Cellular and Molecular Immunology、Cell Discovery、Cell Reports等期刊，总引用超3400次。曾荣获中组部“海外高层次人才青年项目”、欧盟“玛丽-居里奖学金”、德国“洪堡学者”。作为首席科学家，主持科技部重点研发计划“发育编程及其代谢调节”重点专项。此外，实验室长期招收计算生物学、分子细胞生物学、免疫学、基础医学研究生/博士后，欢迎有志之士前来咨询并加入我们的研究团队。 (邮箱：hj.li@siat.ac.cn)。
特别声明：本次研究的所有转录组测序数据都已经按照科技部《人类遗传资源管理条例》的相关要求报备（备案号：2023BAT0642）。所有数据的获取需严格参照科技部有关规定执行。
参考文献
1. Park, M.D., Silvin, A., Ginhoux, F., and Merad, M. (2022). Macrophages in health and disease. Cell 185, 4259-4279.
2. Guilliams, M., Thierry, G.R., Bonnardel, J., and Bajenoff, M. (2020). Establishment and Maintenance of the Macrophage Niche. Immunity 52, 434-451.
3. Mass, E., Ballesteros, I., Farlik, M., Halbritter, F., Gunther, P., Crozet, L., Jacome-Galarza, C.E.,Handler, K., Klughammer, J., Kobayashi, Y., et al. (2016). Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. Science 353.
