刘陈立实验室又一个公式揭秘细菌细胞大小的决定因素

揭示合成生物建构原理

5月18日，国际权威学术期刊《自然•微生物学》发表了中国科学院深圳先进技术研究院、深圳合成生物学创新研究院刘陈立实验室的文章《链接大肠杆菌细胞生长和细胞周期的一般定量关系》，该文章以大肠杆菌为模式生物，揭秘了细菌大小的决定因素，发现了全新的“个体生长分裂方程”，修正了该领域原有的两大生长法则，并对合成生物学领域生命体理性设计提供了相关建构基础原理。

细菌，是自然界分布最广、个体数量最多的有机体。从负责发酵酸奶的乳酸菌到生产胰岛素的大肠杆菌、从与植物共生的根瘤菌到导致伤口感染的病原菌、从分子克隆中用到的剪刀和胶水到基因魔剪CRISPR/Cas9，细菌充斥了人类生活和科学研究的方方面面。每种细菌有着各式各样的可遗传继承的大小，这些微小细胞的体积有时可以相差10⁶-10⁸倍，从0.3微米长的专性胞内病源菌支原体(Mycoplasma)，到600微米长的刺尾鲷肠道内共生菌费氏刺骨鱼菌(Epulopiscium fishelsoni)，再到生长在纳米比亚海边肉眼可见的1毫米长的纳米比亚嗜硫珠菌(Thiomargarita namibiensis)。当然，较大的细菌是极少数的，大多数已知细菌的直径在0.4至2微米之间，长度在0.5至5微米之间。细菌的大小不仅呈现多样化，而且很稳定。即使在温度高达100度以上的热液口、盐浓度高达5摩尔的盐湖、离子放射性强度超过人类致死剂量1000倍等条件下，这些环境中的细菌细胞仍然保持特定的大小。长久以来，细菌的大小一直是细菌分类学中一个不可缺少的性状，同时特定的大小使得细菌能更适应其生存环境。过去100年来，生物学家一直想知道是什么决定了细胞的大小。在近代，虽然我们知道了大部分控制细菌细胞周期和细胞分裂的分子，但我们仍然不知道细菌细胞的大小是如何确定的（图一）。

图一：不同大小的细菌细胞

上述问题是微生物生理学领域重要的基础科学问题，回答该问题对于厘清细菌细胞生长和周期控制的基本规律及其分子调控机制，指导人工生物系统的设计和构建有着重要的意义。

六十年经典

定量微生物生理学领域两大定量法则

人们对细菌细胞生长和细胞周期控制规律的研究历史可以追溯到19世纪中期。直到上世纪50年代，人们对于细菌细胞生长规律的认知还主要集中于对细菌细胞生命周期描述。在当时，人们认为，细菌细胞的整个生命周期可以分为延迟期、对数生长期、静止期和衰亡期（即S形生长曲线，图二），细菌细胞都不可避免的要经历上述几个时期，这一观点直至今日仍具有广泛的影响力。

图二：细菌细胞生长曲线（S形生长曲线）

自上世纪40年代起，得益于相关实验方法和观念的更新，微生物生理学的研究进入了新的阶段。Alfred Hershey（1969年诺贝尔生理学或医学奖获得者）发现，通过定期的稀释，细菌细胞可以长时间的维持指数生长状态（对数生长期，图三），说明S形生长曲线描述的并非细菌细胞必然经历生长阶段。基于类似培养方法，Jacques Monod发现细菌细胞在含有两种碳源的培养基中存在“二次生长”现象，进而揭示了“乳糖操纵子”的调控机制，并因此获得了1965年诺贝尔生理学或医学奖。他明确指出：所有的微生物学相关的研究都应该关注培养方法。这一观点为微生物生理学研究带来了跨越性的发展。

图三：细菌细胞可以长时间维持指数生长状态

1958年，Schaechter等发现：当细菌细胞的生长速度增加一倍，细胞的大小增大到两倍；生长速度增加两倍，细胞的大小增大到四倍。即是说只要知道细胞生长快慢，就可以准确推断出细胞大小，反之亦然。生命的运行状态自此变得可被预测，这一重要定量关系后来被确认为“Schaechter-Maaløe-Kjeldgaard生长法则（SMK生长法则）”。这篇具有里程碑意义的论文是奠定现代定量微生物生理学领域的基石。

那么，为什么细菌细胞大小和生长速度会有关呢？就这一问题，Donachie于1968年在《自然》杂志发表观点认为，每次细胞分裂都可以追溯到恒定的C+D周期（对应一小时）之前对应一个复制起点上发生的DNA复制起始事件，而触发该事件的原因是对应的细胞大小积累达到了“起始质量”；不同生长速率条件下，“起始质量”保持恒定（图四.起点）。从恒定的“起始质量”开始，在恒定的C+D周期内，细胞以特定的生长速率指数生长（图四.过程），因此分裂时细胞的大小和生长速率之间存在指数的关系(图四.结果)。这一假说完美契合了前述SMK生长法则，形成了一个很有吸引力的细菌细胞周期控制机制范式模型，回答细菌细胞大小的决定因素以及在何时分裂这一具体科学问题，被称为“恒定起始质量假说”。

图四：恒定起始质量假说

在两大法则提出后的半个多世纪，科学家在“恒定起始质量假说”和“SMK生长法则”共同描述的范式框架下思考，试图寻找其背后的分子机制，但始终未能如意。而另一方面，越来越多的学者逐渐认识到在细菌慢速生长的情况下，由于C+D不再保持恒定，“SMK生长法则”和“恒定起始质量假说”这两个法则不能同时成立。那么，上述两个法则的适应范围究竟如何？是否能找到更加普适性的规律，修正半个世纪以来学术界主流的细菌细胞生长法则，形成新的细菌细胞周期控制范式模型呢？

系统性重复验证

修正原有两大经典法则

刘陈立团队通过选取超过30种不同培养基，探索了细菌在更广泛生长速率条件下细胞周期的调控机制，是迄今为止有报道的类似研究工作中选用培养基种类最多、覆盖生长速率范围最广的研究。

稳定的实验系统、准确可靠的定量方法是实验科学研究得以顺利开展的重要前提。为此，研究人员建立了新的细菌培养流程，通过同时测定群体总的生物量和细胞浓度，验证了稳态生长状态，确保所有的实验数据稳定。

在此基础上，研究团队对主导了细菌细胞周期相关研究长达半个多世纪的“SMK生长法则”和“恒定起始质量假说”进行了系统性重复验证，在长达三年多，最多进行了9次重复试验的坚持下，结果表明：虽然生长速度越快，细胞越大，但二者之间定量关系并不符合SMK生长法则的预期。当开始新一轮DNA复制时，细胞大小和此时细胞内的复制起点数的比值（起始质量）并非保持恒定，而是随着生长速率的升高呈现先上升后下降的非单调的变化趋势。这一结论表明，无论任何生长速度范围，“SMK生长法则”和“恒定起始质量假说”本身都并不准确。

该结论修正了原有两大法则，禁锢研究者六十年之久的规则有可能被打破，这意味着，未来研究有机会从原有研究范式中被解放出来，研究人员可以从新的角度和方向来重新思考细菌细胞生长和细胞周期控制的相关问题。而这其中，最重要的问题是：如果细菌细胞分裂不是直接由DNA复制起始决定，那么“细菌到底何时分裂？”

玩转数据 

发现全新“个体生长分裂方程”

细胞在何时分裂直接决定了细胞大小。明晰细胞大小和细胞周期相关参数之间的定量关系对于回答“细菌细胞大小的决定因素”这一科学问题具有重要指导意义。研究团队通过梳理大量定量实验数据，寻找数据背后的决定机制，最终揭示了一个全新且适用于不同生长速率条件的“个体生长分裂方程”（图五）：

图五：个体生长分裂方程

在这一定量关系中，细胞大小指向细胞分裂控制机制，生长速率代表细胞生长，C+D周期隐含染色体相关事件；即“个体生长分裂方程”提示细菌细胞分裂的控制机制和细胞生长以及染色体相关事件密切相关。

在梳理不同实验测量参数间相关性的过程中，研究团队发现可以用一个简单的数学公式来描述所有培养条件下C+D周期和生长速率之间的关系，即

通过回顾大量已有文献报道的数据，研究团队进一步验证了该定量关系。基于该定量关系和“个体生长分裂方程”，只要知道细胞周期相关参数其中的一项，即可预测其他参数对应的数值。如：已知生长速率，代入公式可知对应情况下的细胞大小、C+D周期和起始质量等细胞周期相关数值。

简言之，在修正经典法则，将研究人员从前人的研究范式思维中解放的基础之上；新的个体生长分裂方程式的提出，使得细菌个体大小、生长速率等自然现象具有了一定的可预测性，将为研究人员提供新的研究范式和思维方法，解答细菌细胞大小和DNA复制周期以及生长速度之间的关系，并具有广泛的应用价值。

理性分析

提出全新细菌细胞分裂控制机制

关于细菌细胞分裂机制，目前学术界主要存在两种不同的观点：其一是“恒定起始质量假说”为代表，认为细菌细胞分裂完全受控于染色体复制起始事件；其二是细菌细胞在何时分裂取决于细胞生长带来的生物量积累的观点。

在个体生长分裂方程的基础上，研究团队提出了新的细菌细胞分裂控制机制：细胞分裂直接受控于同细胞分裂这一生物学过程直接相关的事件，细菌细胞分裂需要同时考虑细胞生物量的积累和染色体相关事件。当特定“分裂许可物”（如分裂复合体、细胞隔膜等）的积累达到一定的阈值时细胞就会分裂，而“分裂许可物”的形成取决于关键原材料供给以及组装效率两个方面，分别对应生物量的积累和染色体相关事件。

基于上述猜想，研究团队进一步建立相应的数学模型来描述细菌细胞分裂的控制机制。该模型成功重现了包括“个体生长分裂方程”、“细胞分裂的增量现象”、“群体内细胞大小分布”等在内的一系列群体或者单细胞水平实验观测到的实验现象。基于定量蛋白质组学分析，研究团队发现包括FtsZ、FtsK、ZipA在内的蛋白质衔接了细胞生物量的积累和染色体事件，作为参与形成可能“分裂许可物”的关键蛋白质原材料，其浓度在不同生长速率条件下基本保持恒定，因此原材料的积累就等价于细胞生物量的积累，进一步佐证了上述猜想。

从原理解析到指导建构

推动合成生物学发展

本项研究围绕“细菌细胞大小的决定因素”这一重要基础科学问题，例证了定量思维和对历史悠久研究结论展开回顾性研究，在生命科学研究中的重要性和必要性，其所揭示定量规律对于理解细菌细胞生长和细胞周期运行有着重要的指导意义。

本项研究的结论将有可能引导学者将研究关注点从过去的“恒定起始质量”转向“分裂许可物”的形成和决定机制，以及它与染色体事件之间的联系，从而进一步探索生命得以存在和延续的原理。

从长远的角度来看，揭示并理解相关定量规律和法则是人们得以根据需求创造新事物的基石。“伯努利方程”指导了飞机的设计；“阿基米德浮力定律”推动了潜艇的面世；“牛顿第二定律”是人类得以翱翔地球外太空的重要理论基石。合成生物学的终极目标就是理性的设计、改造现有生命形式或者创造全新的生命形式以满足人类不同的需求，本项研究所发现的定量规律以及细菌分裂控制机制在合成生物学领域有潜在应用前景。大小是一个细胞最外在的特征，设计一个细胞首先就需要考虑这个细胞应该长多大，本项研究揭示的定量规律提示可能可以通过控制生长速度和染色体相关事件运行的速率来实现特定的细胞大小这一目的。分裂是所有生命形式最本质的需求，本项研究提出的细菌细胞分裂的控制机制对理性设计、创造满足人类需求的分裂模式有着潜在的参考价值。总而言之，这次对细菌个体细胞相关定量规律和法则的基础科学问题研究，对人类揭示并理解生命体内在原理提供了重要的参考依据，此研究也有助于未来合成生物学领域的理性设计和建构，以满足细菌治疗疾病、抗生素替代、绿色生物制造等多个应用层面的需要。