Nature Communications | 利用工程细菌编辑功能性半互穿网络聚合物_合成生物

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Nature Communications | 利用工程细菌编辑功能性半互穿网络聚合物

发布时间 2021-06-21 10:45点击次数 213次

互穿网络聚合物(Interpenetrating Polymer Network)由两种或多种各自聚合交联的组分连续并相互穿透所组成。在IPN中,如果仅有一种聚合物是交联的,另一种聚合物是线型非交联的,则称其为半互穿网络聚合物(semi-IPN)。半互穿网络聚合物可以融合了两组分的特性及优点。例如第一组分及第二组分分别具有温度及pH灵敏性,则半互穿网络聚合物兼具两者的灵敏性。同时网络互穿的性质可有效地提高各组分的稳定性并调控其力学性能。

合成IPN或semi-IPN通常采用分步法,即使在已经交联的聚合物(第一网络)置入第二单体、引发剂、交联剂等,然后使第二单体就地聚合或交联形成穿插于第一网络的第二组分。迄今为止开发的体系多采用传统的高分子化学合成方法,与生物大分子很难兼容。而生物大分子,例如酶等可以为semi-IPN带来催化等多种活性。目前开发的化学工具可以使用点击化学等将蛋白修饰在高分子骨架上,然而这种方法不具有普适性,步骤繁琐且会一定程度上影响蛋白活性。另一方面,随着蛋白质工程的快速发展,科学家们开发了可在温和环境下合成并具有生物活性的蛋白质水凝胶体系(共价交联或非共价交联)。然而目前该方向的大部分系统利用纯化后的蛋白组装而成,流程繁琐且成本较高。更重要的是,传统方法合成的材料不具备复原性能,一旦其在扰动环境下失去活性,其活性便无法再生。

随着合成生物学的快速发展,利用工程细菌组装活体材料,使其具有生物的活体性能(可再生、自修复等)成为了造物致用的新方向。2014年以来,活体材料在编辑工程细菌的生物被膜并组装相关材料上取得了长足的发展。然而目前的研究中,活体材料中的“活”字大多体现在材料的制备过程中,即是利用生物自己产生生物膜并将全细胞构建成为材料。而在材料性能上,生物本身的特性,尤其是其活体性质还缺乏较好的体现及利用。

基于现有的问题,中国科学院深圳先进技术研究院的戴卓君副研究员和杜克大学的游凌冲教授等研究者结合合成生物学、蛋白质工程及高分子物理化学,提出了一种全新的可模块化、多样化融合蛋白组分的活体semi-IPN的构建思路:通过微凝胶包裹植入基因线路的两种大肠杆菌。微凝胶本身的交联网络提供第一组分,并作为物理支架支持工程细菌的生长;两种工程细菌在胶囊中生长达到一定密度后,感知到胶囊的物理空间局限从而自主裂解,释放出体内表达的两种蛋白单体;两种蛋白单体(修饰有可共价反应的蛋白标签SpyTag或SpyCatcher)原位聚合,形成第二组分(聚合的蛋白)并与第一网络互穿。由于蛋白单体的可编辑性,可灵活的融合各种活性分子于蛋白单体,组装修饰有各种活性蛋白模块的活体semi-IPN。

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图1. 合成semi-IPN的思路。a) 传统的方法合成semi-IPN;b) 利用合成生物学实现可模块化、多样化融合蛋白组分的活体semi-IPN的构建思路。

在具体实施步骤中,作者利用实验室之前构建的ePop回路编辑细菌基于密度的自裂解性能。在ePop回路的设计中,细菌表达一种来源于噬菌体phix174的E蛋白,E蛋白会阻碍大肠杆菌细胞壁的合成,当细菌密度达到一定程度时,积累的毒素就会导致细菌裂解;利用弹性蛋白作为第二组分的骨架,并在弹性蛋白上融合表达多个可反应的蛋白标签(SpyTag或SpyCatcher);构建两种细菌,共培养两种细菌时,细菌生长、部分裂解释放两种蛋白单体,两种蛋白单体即可原位聚合;利用壳聚糖高分子作为胶囊制作的材料,利用壳聚糖与三聚磷酸分子构建交联体系(第一网络)并包裹两种细菌,细菌裂解释放的两种蛋白单体原位聚合形成第二组分(polymerized protein),与第一网络互穿形成活体semi-IPN。

测试表明,活体semi-IPN具有更好的机械性能,并具有抵御环境扰动的自修复性能。当制备修饰酶的活体semi-IPN,并将该酶的抑制剂短期或长期与材料共同孵育时,作者发现普通材料的酶活性全部丧失,而活体semi-IPN极高的保存了其活性。例如,当我们将抑制剂加入10分钟后,活体semi-IPN的活性迅速下降,但是当我们将材料重新放入培养基培养24小时后,其酶活性又可重新回到扰动前的水平。

利用活体semi-IPN保护抗生素扰动下的肠道菌群

为进一步展示该平台优势以及潜在的应用场景,作者尝试在一种蛋白单体下游融合β-内酰胺酶,制备融合有β-内酰胺酶的semi-IPN,并利用该材料保护抗生素扰动下的肠道菌群。

肠道菌群(gut microbiota, GM)是人体的一个重要“器官”。各类细菌在肠道内保持共生或拮抗关系,共同形成一个动态平衡的微生态系统,参与调控机体生理功能。然而,肠道菌群的微生态平衡系统极易受外界因素影响而发生紊乱,抗生素的使用即是其中最常见的因素之一。临床上,在必要时利用静脉注射抗生素可对感染进行快速清除。然而,小分子的抗生素会快速的渗透到肠道环境,而其广谱抗菌性会极大的影响到肠道内菌群原有的平衡,并可能使部分细菌对抗生素产生耐药性。

β-内酰胺类抗生素是现有的抗生素中使用最广泛的一类。目前已有临床实验,通过口服蛋白药物β-内酰胺酶来进行在肠道环境对抗生素的降解。然而,蛋白质类药物通常具有分子量大、易受酶降解、渗透性低、以及受胃肠道环境影响易于聚集、吸附、变性等性质。而药物进入肠道后进一步被肽酶降解成小分子肽或氨基酸,酶降解可发生在肠腔内、肠绒毛刷边、肠细胞的胞浆、细胞内的溶酶体和其他细胞器,这是蛋白质药物在肠道失去生物活性的主要原因。这使得目前β-内酰胺酶的使用需要大剂量,高频次才能达到一定效果。而活体semi-IPN的特性使得其潜在具有更好的效果:首先,工程细菌不停产生并组装具有β-内酰胺酶的材料;并且,互穿网络的结构极大的提升了β-内酰胺酶的稳定性。实验结果也进一步印证了作者的猜想,他们首先将β-内酰胺酶融合到其中一种蛋白单体,构建活体semi-Bla-IPN。当把活体semi-Bla-IPN灌胃给小鼠时,他们发现相对于其他对照组(包括胶囊包裹纯化后的β-内酰胺酶,且其含量是semi-Bla-IPN起始含量的2.5倍),服用活体semi-Bla-IPN的小鼠在菌群的总体含量以及菌群结构分布上都维持了更加显著的稳定性。
总结

目前的活体功能材料领域主要聚焦于编辑及改造生物膜,作者试图采用一种全新的思路,结合合成生物学、蛋白质工程及高分子物理化学搭建一种普适性的活体材料构建方法,并使其具有半互穿网络聚合物的良好性能。根据他们的设计,裂解模块和第一层网络的每一个部件都是可替换以及可优化的。例如裂解模块的基因线路可以被替换成其他编译细胞裂解的基因线路;第一层网络结构可以根据需求替换成其他高分子,并通过调整孔径尺寸、表面修饰等实现性能优化;蛋白单体序列可以融合任意具有活性的蛋白模块;预期该方法可以设计多种具有不同功能的活体semi-IPN,包括融合多种酶利用级联反应实现生物合成;融合重金属结合酶或危害物降解酶实现环境保护或循环;以及进一步融合其他治疗性蛋白实现疾病诊断及治疗等。

这一成果近期在Nature Communications 上发表,中国科学院深圳先进技术研究院的戴卓君副研究员和杜克大学的游凌冲教授是该工作的共同通讯作者。

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Living fabrication of functional semi-interpenetrating polymeric materialsZhuojun Dai, Xiaoyu Yang, Feilun Wu, Lihua Wang, Kun Xiang, Pengcheng Li, Qingqing Lv, Jinhui Tang, Anders Dohlman, Lei Dai, Xiling Shen & Lingchong You Nat. Commun., 2021, 12, 3422, DOI: 10.1038/s41467-021-23812-7

导师介绍

戴卓君实验室拟招聘具有合成生物学、高分子合成、蛋白材料、代谢工程等相关研究背景博士后及科研助理。
戴卓君,中科院深先院合成生物学研究所副研究员,课题组的研究方向是编辑合成功能菌群并结合高分子化学与物理的手段实现生物制剂及活体材料的智能制造。相关成果以第一作者或通讯作者发表在Nature Chemical Biology 、Nature Communications等国际专业期刊。

戴卓君https://www.x-mol.com/university/faculty/302693

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